Видове флуоресцентни микроскопи

Около 1600 г. се появяват първите микроскопи и философите‑естествоизследователи за пръв път вратат поглед към микроскопичния свят. Когато Антони ван Левенхук изработва малки, силно изкривени лещи и механичен държач за настройка, той отваря прозорец към бактерии, кръвни клетки, протозои и клетъчната структура на растенията. През цялата история на микроскопията един въпрос остава – какво точно се вижда през лещата? Флуоресцентната микроскопия отговаря на този въпрос, защото образците самите излъчват светлина, след като бъдат осветени.

Епифлуоресцентен микроскоп

Най‑широко използваната конфигурация е епифлуоресцентната. Светлинен източник – обикновено ртътен или ксенонов лампа – преминава през филтър, който избира тесен спектрален диапазон. Филтрираната светлина се фокусира върху пробата чрез обектив. Флуорофорите в пробата абсорбират светлина с къса дължина и излъчват светлина с по‑дълга дължина. Отразената светлина и разсеяната от източника се събират от обектива и се насочват към детектора или окото, като втори филтър премахва оставащата осветяваща светлина, оставяйки само флуоресцентния сигнал.

Конфокален микроскоп

Епифлуоресцентният микроскоп събира светлина от целия обхват на зрителното поле, включително извън фокуса, което намалява остротата на изображението. Конфокалният микроскоп решава този проблем, като използва лазерен лъч, фокусиран точно в плоскостта на наблюдение. Пред детектора се поставя малка отвертка (пинхол), която блокира светлината, идваща от извънфокусни зони. Сканирайки пробата, се получава чисто тримерно изображение.

Мултифотонен микроскоп

Конфокалните системи изискват прецизно подравняване на лазера, обектива, оптиката за събиране и пинхола. Мултифотонният микроскоп избягва тази чувствителност, като използва лазер с дължина на вълната, половината енергийна от необходимата за директно възбуждане. Флуорофорите се активират само когато два фотона удрят почти едновременно, което се случва само в изключително малък фокален обем. Така само мястото, където е фокусиран лазерът, излъчва светлина, без нужда от пинхол.

Флуоресценция при тотално вътрешно отразяване (TIRF)

Този метод осигурява изключително чисти изображения, като ограничава проникването на възбуждащата светлина в пробата. Светлината се въвежда странично в стъкленото плоче под ъгъл, при който се получава тотално вътрешно отразяване. Само много тънък слой – около 100–200 нм – над стъклото се осветява. Това е особено полезно за изследване на процеси, протичащи на повърхността на клетки, като невроните.

Суперрезолюционни техники

Всички микроскопи, включително флуоресцентните, са ограничени от дифракционната граница – около 200 нм за видима светлина. За да се наблюдават структури под тази граница, се използват суперрезолюционни методи. Примери са структурирана илюминация (SIM) и стимулирана емисионна деградация (STED). Тези техники намаляват размера на светлинния сноп, позволявайки визуализация на молекули с размери от няколко нанометра.