Видове флуоресцентни микроскопи

Когато микроскопите са измислени около 1600 г. сл. Хр., естествените философи са насочили погледа си към свят в един свят. Когато Антони ван Левенгук изработил малки, силно извити лещи и механичен държач за регулиране на изгледа, той отвори прозорец към микроскопичния свят на бактерии, кръвни клетки, протозои и клетъчната структура на растенията. Но в историята на микроскопията винаги е имало един въпрос: Какви са тези странни неща, наблюдавани през обектива? Флуоресцентната микроскопия се отнася до набор от техники, които минимизират тази несигурност - защото при флуоресцентна микроскопия, когато светлината е светеща върху проба, тя сияе собствената си светлина обратно.

Епифлуоресценция най-често срещаният флуоресцентен микроскоп е епифлуоресцентната конфигурация. В епифлуоресцентен микроскоп, светлинен източник - обикновено живачна или ксенонова лампа - свети през филтър, който избира тясна област от дължини на вълните. Филтрираната светлина свети върху пробата през обектива на микроскопа. Входящата светлина се абсорбира от флуорофори - молекулярни етикети, които излъчват светлина с дълга дължина на вълната, когато абсорбират светлина с по-къса дължина на вълната. Светлината от флуорофорите, заедно с разсеяна светлина от източника на осветление, се връща обратно в обективната леща и към детектор или око. По пътя друг филтър блокира светлината на осветлението, така че остава само флуоресцентната светлина от пробата.

Конфокален
Епифлуоресцентен микроскоп събира светлина навсякъде в зрителното поле на микроскопа. , Част от светлината на възбуждане се абсорбира преди фокалната равнина на микроскопа, някои в фокалната равнина и някои извън фокалната равнина. Тъй като микроскопът събира цялата светлина, изображението ще съдържа рязко изображение на светлината във фокуса, но ще има и светлина извън фокуса от други региони. Конфокален микроскоп фиксира това чрез фокусиране на лазерното петно ​​в същата равнина, в която е фокусиран микроскопът. Тогава пред детектора минава дупка, която блокира цялата светлина, която не идва от фокуса на микроскопа. Чрез сканиране на извадката може да се получи чисто триизмерно изображение на обекта.

Multiphoton
В конфокален микроскоп подравняването е много чувствително. Ако лазерното петно, целта на микроскопа, събиращата оптика и отворът са изключени дори и при най-малкото количество, микроскопското представяне страда. Многофатонен микроскоп заобикаля този проблем чрез използване на дължина на вълната на лазера, която е само наполовина по-енергична от необходимостта да се възбуди флуорофорите в пробата. Единственият начин флуорофорите да се развълнуват и да излъчват флуоресценция е, ако лазерната светлина е достатъчно ярка, така че две частици светлина - фотони - удрят флуорофора за много кратко време. Това се случва само когато лазерът е фокусиран на много малко място. Така че единственото място в извадката, което ще излъчва светлината, е мястото, където е фокусиран лазерът, което запазва изображението хубаво и чисто, защото няма допълнителна фонова светлина, от която да се отървем - което означава, че няма дупка, която да се подравни.

Общо вътрешно отражение флуоресценция (TIRF)
Друг начин да получите много чисти изображения е да се уверите, че светлината на възбуждане не се получи много далеч в пробата. Ако например капка неврони се постави в капка разтвор на предметно стъкло, тогава някои от невроните ще се прилепят към повърхността на стъклото. В общия микроскоп за вътрешно отражение флуоресценция (TIRF) светлината се насочва настрани в предметното стъкло, така че всъщност не я превръща в разтвор, държащ клетките. Но част от светлината едва изтича в разтвора - съвсем близо до повърхността на стъклото. Това означава, че единствените места, които ще излъчват светлина, ще бъдат в много тънък район, точно срещу стъклената повърхност. За нещо като неврони, където се случват толкова много интересни неща на повърхността на клетките, тази техника може да бъде много ефективна.

Super-Resolution
Всички микроскопи - включително флуоресцентните микроскопи - са ограничени от физика, която управлява разпространението на светлината. Едно от основните правила е, че фокусираното място на светлината може да стане толкова малко - и не по-малко. За видимата светлина този размер е около 200 нанометра или 200 милиардни от един метър. Но отделните молекули са с размери само на няколко нанометра, така че има много интересни характеристики, които са под тази граница на размера, наречена дифракционна граница. Учените разработват техники за "супер-резолюция", за да се промъкнат около тази граница. Микроскопията със структурно осветяване (SIM) и микроскопията със стимулирано изчерпване на емисиите (STED), са двата метода на флуоресцентната микроскопия, които ограничават размера на светлинно-излъчващото място чрез свиване на размера на светлинното място на възбуждане.
URL:https://bg.whycomputer.com/hardware/100207040.html